首页 > 澳门赌场网站新闻
陈宝辉的研究小组在Nature Communications上发表了一种新的活细胞染色质成像方法 资料来源:admin 发布日期:2018-11-30 访问量:67

在2018年11月29日,Nature Communications发表了一篇题为使用CRISPR-Tag对活细胞中蛋白质编码基因进行高效标记和成像的研究论文。本研究为非重复DNA序列提出了一种新的标记策略,可以对活细胞中特定蛋白质编码基因DNA元件和蛋白质进行有效的双重标记,从而探索基因定位与基因表达之间的关系。奠定重要的技术基础。

在真核细胞中,基因组DNA以染色质的高级形式存储在细胞核的三维空间中,因此命名为“三维基因组”。三维基因组结构的异常与多种人类疾病的发生密切相关。基因组的三维结构是动态变化并且呈现单细胞异质结构。因此,在活细胞状态中,使用单细胞分辨率研究基因组的三维结构的动力学和功能是特别重要的。在3D基因组领域有许多重要的科学问题值得探讨。例如,什么分子是核中特定基因的位置?基因或调控元件在什么情况下从细胞核中的一个位置移动到另一个位置?空间位置的哪些变化是由哪种蛋白质分子介导的?这个位移的时间是否正常并受某种机制控制?这背后的生物学意义是什么?这一系列问题也适用于三维基因组结构概念的任何方面,例如形成不同的三维结构,例如染色质环,拓扑相关结构域,染色体区室或染色体结构域。

近年来,活细胞DNA标记技术作为实时成像工具受到极大关注,这对于研究基因组是必不可少的。核酸酶失活的Cas9,称为dCas9,与荧光蛋白融合,经过系统优化后,可以在人体活细胞中实时标记和跟踪细胞核中特定基因或特定调控元件的位置和动态变化。该技术能够在细胞分裂的不同阶段在多种细胞类型中进行基因组DNA特异性标记,并能够对目标成分进行长达10小时的动态观察,证明了该技术的广泛应用潜力。

尽管近年来基于CRISPR-Cas9的活细胞DNA成像技术得到了很大发展,但大多数工作仅限于用重复序列标记DNA片段。没有重复序列的基因标记仍然存在重大挑战。技术困难主要体现在以下事实:为了在背景之上富集足够强的信号,不含重复DNA序列的基因标记需要表达26-36个sgRNA。然而,不同sgRNA的活性差异很大。尽管有许多设计软件可以预测sgRNA活性以帮助我们筛选目标,但仍无法准确确定细胞中sgRNA的活性。因此,没有重复序列的基因组基因座在标记方面效率较低。本研究使用一种新策略来创建新的活细胞DNA标签,称为CRISPR-Tag(图1)。该标签的DNA序列来自线虫的基因组,其可被Cas9有效切割。这些DNA序列未在人类基因组中发现,但被整合到人类基因组中以被Cas9有效识别。因此,CRISPR-Tag可以有效地将dCas9-FP荧光分子募集到特定的基因组位点以进行DNA标记。此外,通过优化CRISPR-Tag的插入位点,将其巧妙地隐藏在荧光蛋白的内含子序列中,然后将荧光蛋白DNA序列插入靶蛋白编码的N末端或C末端。 CRISPR敲入基因。 。荧光蛋白作为CRISPR敲入的报道分子的表达使得能够快速建立该系统,同时实现靶基因的DNA和蛋白质的双重标记而不影响靶蛋白的表达。这组工具理论上适用于标记任何蛋白质编码基因而没有重复序列,并且不再受sgRNA活性的限制。蛋白质编码基因是基因组中最重要的功能元件。研究核位置变化与这些基因转录活性之间的关系将极大地丰富我们对三维基因组的理解。

未标题-1.jpg

图1:汇编CRISPR-Tag标签,有效地将活细胞中的DNA和蛋白质双重标记(Chen et al,Nat Commun.2018)

陈宝辉博士,澳门赌场网站医学院细胞生物学系/澳门赌场网站血液病研究所,是该研究的第一作者。加州大学旧金山分校的陈宝辉教授和黄博教授是该研究的作者。参与研究的作者是陈宝辉研究组的硕士生徐海月,博士生梁莹和澳门赌场网站转化医学研究所研究员邹宇。

链接:https://www.nature.com/articles/s41467-018-07498-y

TR

【关掉】